Leonardo estudou profundamente a anatomia humana e de animais, principalmente de cavalos. Dissecou mais de trinta corpos de homens e mulheres de todas as idades, quando a dissecação era prática rara e mesmo mal vista, condenada pelo papa Leão X.
Pesquisou a estrutura dos ossos, representou o tórax, a bacia, a coluna vertebral e o crânio, que desenhou em planos ainda utilizados em atla anatômicos. Observou alterações ósseas com a idade do indivíduo, a posição dos ossos. Dedicou cento e quarenta desenhos à localização dos músculos, estudou a posição relativa dos mesmos, dos vasos e dos nervos.
Descobriu a glândula tireóide, bem como a existência de várias outras. Analisando o sistema urogenital, fez anotações impressionantes sobre a placenta, o cordão umbilical e as vias de nutrição fetal. Examinou ainda o sistema nervoso central e periférico, bem como os órgãos dos sentidos.
Estudou o coração, concluindo que este órgão é puramente massa muscular alimentada por veias, como todos os outro músculos.
Impressionado com sua descoberta de 24 músculos na língua, procurou analisar a posição deste orgão, dos lábios, dentes, traquéia e cordas vocais, realizando pesquisas em Foniatria e Fonoaudiologia, ramos estruturados como disciplinas científicas somente no século XX.
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